Uji Biokimia

Uji Biokimia

Reaksi Biokimia

Reaksi biokimia : reaksi kimia yang terjadi pada makluk hidup.

Prosesnya dibedakan menjadi 2 yaitu :

1. A Anabolisme (Biosisntesis)

Reaksi penyusunan molekul sederhana menjadi molekul komplek dan reaksi ini membutuhkan energy.

Contoh : pembentukan protein dari asam amino

2. K Katabolisme

Reaksi pembongkaran molekul kompleks menjadi molekul sederhana dan reaksi ini melepaskan energy.

Penggolongan enzim yang dibutuhkan pada metabolisme bakteri:

Ø Endoenzim :

- Bekerja dalam sel.

- Bersifat anabolic dan katabolic.

Ø Eksoenzim :

- Enzim yang disekresikan keluar sel dan berdifusi keluar media.

- Bersifat hidrolitik ( menguraikan molekul komplek menjadi molekul sederhana sehingga molekul ini dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel ).

Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia :

- Dapat dilihat dari interaksi metabolit yang dihasilkan dari reagen kimia.

Kemampuan menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan energy

Catalase test

Tujuan :

- Mendeteksi adanya deteksi enzim katalase pada bakteri.

- Membedakan bakteri anaerob obligat aerobik dan, sebagai anaerob umumnya diketahui kekurangan enzim .

- uji katalase sangat berharga dalam membedakan strain aerotolerant dari Clostridium, yang katalase negatif, dari Bacillus, yang katalase positif.

Prinsip :

Enzim katalase berfungsi untuk menetralisir efek bakterisidal hidrogen peroksida .Enzim katalase jika kontak dengan hydrogen peroksida akan bereaksi melepaskan air dan oksigen. Oksigen akan lepas membentuk gelembung cepat yang dapat diamati ( H₂O₂ + enzim katalase = H₂O + O₂ )

Cara kerja :

Setetes larutan H2O2 diletakkan diatas objek glass dan sedikit pertumbuhan bakteri diletakkan larutan tersebut .

Gambar. 1. Slide katalase hasil tes. (Atas) Reaksi positif yang dihasilkan oleh Staphylococcus aureus, (bawah) reaksi negatif yang dihasilkan oleh Streptococcus pyogenes

Uji Catalase test positif →timbul buih /gelembung ( genus Straphylococcus, Listeria katalase, Corynebacterium diphtheriae, Burkholderia cepacia, Nocardia, Keluarga Enterobacteriaceae (Citrobacter, E. Coli, Enterobacter, Klebsiella, Shigella, Yersinia, Proteus, Salmonella, Serratia, Pseudomonas), Mycobacterium tuberculosis, Aspergillus, dan kriptokokus. )

Uji Catalase test negative →tidak timbul buih /gelembung (Streptococcus,Lactobacillus, Clostridiumenterococci)

Gambar: Katalase positif reaksi menunjukkan infeksi S. Aureus

Oksidasi dan Tes Fermentasi Karbohidrat

Fermentasi dapat terjadi secara aerob / anaerob

Bakteri memakai karbohidrat (nutrisi ), terbentuk produk akhir gas dan asam

Metabolisme karbohidrat ( glukosa / laktosa ) ,hasilkan subtrat .

Bakteri memakai enzim pada fermentasi dan oksidasi →kemungkinan gas tidak terbentuk.

Proses Fermentasi →asam ( perubahan warna ) dan gas ( terbentuk ruangan kosong pada tabung durham )

Jika pada media terdapat indicator fenol red :perubahan warna merah (netral / basa)→kuning ( asam hasil fermentasi ).

Bila diinkubasi lebih dari 24 jam , terbentuk NH3 ( basa) menyebabkan suasana menjadi netral ( berubah jadi merah – fenol red )

Metil Red dan Voges Proskauer ( MR VP )

ü TTujuan : membedakan antara organisme yang mampu mengubah glukosa menjadi pyrufat.

1. Melalui jalur asam campur , hasilkan poduk asam lactat, acetic dan asam asam formiat (asam campur) yang stabil dan akan tetap asam.

2. Melalui jalur butilena glikol, hasilkan produk akhir netral termasuk acetoin dan 2,3 – butanadiol.

ü M MR – VP : media kaldu yang mengandung pepton, buffer, dan glukosa.

ü F Fungsi uji MR : mendeteksi bakteri menggunakan jalur asam campur , hasil akhir asam maka tidak terjadi perubahan warna methyl red ( merah ).

Prinsip : Uji Methyl Red + Indikator methyl red pada media pepton yang ditanami bakteri →Tes positif (merah )

Cara kerja :

- Air pepton dalam tabung ditambahkan dalam biakan bakteri,diinkubasi 24 jam.

- Ditambahkam reagen Metil Red, dikocok. Jika terjadi warna merah maka MR → positif , warna kuning → negative.

ü P Perbedaan Methyl red dan Fenol red dalam suasana asam.

Metil red : Merah

Fenol red: Kuning

F F Fungsi uji VP : mendeteksi bakteri bakteri yang menggunakan jalur fermentasi butilena glikol, hasilkan acetoin (netral).

Prinsip : reagen VP + pada media yang ditanamami bakteri, hasil akhir fermentasi →acetoin yang mengandung KOH akan teroksidasi menjadi diacetyl warna merah karena adanya creatin sebagai katalisator.

Cara kerja :

- Air pepton pada tabung + reagen alfa naftol 0,5% 0,2 ml dikocok + KOH 40% 0,2 ml dikocok.

- Jika bagian atas media berwarna merah → uji VP positif, Jika media berubah coklat → negative.

- Catatan : Produksi acetoin dipengarui lamanya inkubasi , sehingga kemungkinan hasil negative palsu.

Citrat Test

r Tujuan : Untuk menguji kemampuan bakteri memfermentasikan sitrat sebagai sumber carbon pada media Koser Citrate atau Simmon Citrat.

r Isi media Simmon Citrat :

- Natrium Sitrat → sumber karbon

- Amonium Dihidrogen Phosphat→ sumber nitrogen , dan nutrient lain

- Indikator Brom Thymol Blue ( berubah warna jadi biru→ asam)

r Prinsip :

Bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber carbon tunggal, dengan bantuan emzim citrate permease maka bakteri akan menyebarkan citrat kedalam sel. Selain itu bakteri mengubah Amonium Dihidrogen Phosfat menjadi Amonium Hidroksida (NH₃) dan amoniak yang bersifat basa. Pada pH 7,5 keatas indicator BTB akan berwarna biru , sedangkan pada pH netral akan berwarna hijau.

r Uji Citrat positif → media menjadi biru , jenis bakteri Citrobacter dan sebagian Enterobacter)

Uji Citrat negative → media tidak berubah warna ( hijau ), jenis bakteri Escherichia coli dan Klebsiella.

r Produk lain yang terbentuk : Hidrogen Sulfida (H₂S)

SIM MEDIUM

SIM merupakan media untuk membedakan tiga parameter yaitu

- Reduksi Sulfur→ untuk membedakan bakteri enterik

- Uji Indol →bagian dari uji IMViC, untuk membedakan family Enterobacteriaceae

- Uji Motilitas →untuk membedakan jenis bakteri secara umum.

Tujuan utama : untuk membedakan Salmonella dan Shigella.

Kandungan Media SIM : Nutrisi ( salah satunya pepton yang mengandung asam amino termasuk Triptofan), Iron, dan Natrium thiosulfat.

Prinsip Reduksi Sulfur :

Bakteri dapat mereduksi sulfur menjadi hydrogen sulfide, maka hydrogen sulfide akan bereaksi dengan zat besi ( Iron) menjadi ferric sulfide yang mengendap berwana hitam.

Uji Reduksi Sulfur Positif → Warna hitam pada media

Urutan tes : Tes Reduksi Sulfur → Tes Motilitas →Uji Indol.

Prinsip Uji Indol :

Beberapa bakteri menghasilkan enzim tryptophase yang dapat menghidrolisis tryptophan. Hasilnya Indol, Asam Piruvat dan Amonia dengan cara deaminasi.

Cara kerja :

Menambahkan reagen Kovac yang mengandung HCl, n – amyl alcohol dan p-dimethylaminobenzaldehyde (DMABA) kedalam medium SIM, maka DMABA akan bereaksi dengan indol , hasilkan senyawa Quinoidal merah

Uji Indol Positif → pereaksi berubah menjadi merah

Urease Test

Urease broth → media differensial yang dapat membedakan bakteri penghasil eksoenzim yaitu enzim urease ( untuk menghidrolisa urea →amonia karbodioksida)

Fungsi Urease broth : untuk membedakan bakteri genus Proteus terutama Proteus morganella dan Proteus providential dari golongan bakteri enteric lain.

Kandungan Urease broth : Buffer, Urea, sedikit nutrient, indicator phenol red.

Phenol red berubah jadi kuning →lingkungan asam , berubah fuchsia →lingkungan basa.

Prinsip Urease test

Media urea terdegradasi menjadi amoniak menyebabkan lingkungan basa, maka media menjadi pink . Sebagian besar bakteri golongan enteric dapat mendegrasi urea, tetapi lambat.

Fungsi Uji Urease : mendeteksi bakteri yang dapat mendegradasi dengan cepat “rapid urease- positive”,contoh ; genus Proteus

Triple Sugar Iron Agar

TSIA → media differensial yang mengandung lactose, sucrose, dan glukosa dalam jumlah kecil, ferrro sulfat (untuk memperlihatkan pembentukan H₂S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam.^[) , dan indicator phenol red. (Laktose:Sukrose:Glukose perbandingan 10:10:10)

Fungsi : membedakan bakteri enteric yang dapat mereduksi sulfur dan memfermentasi karbohidrat.

Hasil Uji :

- Bakteri memfermentasikan satu dari jenis karbohidrat + Indikator fanol red

→ Perubahan warna menjadi kuning ( suasana asam )

→hanya memfermentasikan glukosa dalam waktu 10 jam pertama , baru terjadi perubahan kuning

→Produksi asam pada lingkungan aerobic :

Daerah miring ( slant ) menjadi kuning , daerah tengah ( median ) menjadi merah ( basa).

→ Produksi asam pada lingkungan anaerobic :

Daerah miring ( slant ) sampai dasar ( butt) menjadi kuning

- Bakteri dapat mereduksi sulfur

→ Gas hydrogen sulfida yang terbentuk akan bereaksi dengan besi membentuk besi sulfida sebagai endapan hitam.( dapat menutupi hasil asam / basa)

→ reduksi sulfur butuh lingkungan asam , endapan hitam menunjukkan fermentasi berlangsung.

→ Jika slant dikaburkan oleh endapan , lihat bagian atas kemiringan ,untuk menentukan terjadi fermentasi glukosa ( merah )/ laktosa / sukrosa ( kuning ).

→jika fermentasi yang dihasilkan gas : adanya celah dalam medium atau seluruh bagian akan terangkat.